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多肽激素標志物酶聯(lián)免疫

[2013/7/6]

  CSA法和改進CSA法的敏感性和存在的問題

  提高IHC敏感性有幾種途徑。一是依靠各種IHC的前處理,例如酶的消化、高溫的抗原修復(fù),雖然對其的基本原理不十分清楚,但卻十分實用;其次是增加IHC方法的放大倍數(shù),主要是酶結(jié)合量的增加。例如EnVison法,一個EnVision葡聚糖多聚物結(jié)合100個左右的酶分子和15個抗體分子,要比二步法S-P(LSAB)上結(jié)合的酶分子多許多倍。

  雖然EnVision法的敏感性大大提高,方法也簡便,但其大分子對于核內(nèi)抗原的定位就不如LSAB法,存在穿透核膜困難的問題。因而,有時EnVision法就不如LSAB法敏感,尤其是活細胞核內(nèi)抗原定位更為困難。CSA法的應(yīng)用,既克服了LSAB法敏感性不高的缺點,又保留了較好的細胞穿透性。

  已有的研究結(jié)果證實(Hasui K,2005;倪燦榮等,1999),CSA法較LSAB法敏感500—1000倍,較EnVision法敏感20~100倍。其對細胞周期素等核內(nèi)抗原的定位,有獨特的優(yōu)點,定位準確性、敏感性、穩(wěn)定性要較標準的CSA法好,其敏感性和穿透性要好于EnVision法。

  最近,Hasui K等(2005)的研究結(jié)果表明,CSA法具有很高的敏感性的同時,也存在嚴重的內(nèi)源性物質(zhì)干擾(內(nèi)源性生物素、內(nèi)源性過氧化物酶、第一抗體與組織細胞內(nèi)的不明物質(zhì)的非特異性結(jié)合),尤其是經(jīng)抗原熱修復(fù)后情況更為嚴重。作者應(yīng)用標準的EnVision法、CSA法和改進(加阻斷劑)的CSA法檢測淋巴結(jié)、正常肝、肝細胞癌、胃腸道鱗癌及癌周正常組織中k167抗原,其檢測最佳效果的標準流程如下。

  (1)4um石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,PBS洗3x3min。

  (2)首先用0.3%過氧化氫甲醇破壞內(nèi)源性過氧化物酶的活性,室溫20min。

  (3)PBS洗3x3min。

  (4)抗原修復(fù),室溫冷卻20min。

  (5)PBS洗3x3min。

  (6)第二次用0.3%過氧化氫PBS破壞內(nèi)源性過氧化物酶的活性,室溫5min。

  (7)用溫的(35℃)TBST[0.02mol/L(pH7.8)Tris—HCl+NaCl+0.1%Tween20]洗3x3min。

  (8)滴加蛋白阻斷劑(0.25%酪蛋白),以阻斷第一抗體的非特異性結(jié)合位點,10min,不洗。

  (9)滴加適當稀釋的第一抗體(在S-P法基礎(chǔ)上5—10倍稀釋),或4℃過夜。

  (10)PBS洗3x3min,溫的(35℃)TBST洗3x3min。37~C孵育15~60min,

  (11)滴加蛋白阻斷劑(0.25%酪蛋白),以阻斷多聚物試劑的非特異性結(jié)合位點,lOmin,不洗。

  (12)多聚物(EnVision)孵育15min,溫熱(35℃)TBST洗3x3min。

  (13)滴加蛋白阻斷劑(0.25%酪蛋白),以阻斷CSA試劑的非特異性結(jié)合位點,10min,不洗;如用熒光素標記酪胺需用TBST洗3次。

  (14)用生物素標記酪胺孵育15rain;如用熒光素標記酪胺孵育15~30rain。溫熱(35~C)TBST洗3X3min。

  (15)鏈霉親和素—HRP 37~C孵育15rain或HRP標記的抗FITC抗體孵育30rain,溫的(35℃)TBST洗3X3min。

  (16)0.04%DAB(含0.03%Hz02)顯色5~10min。

  (17)復(fù)染、脫水、常規(guī)樹膠封固和結(jié)果觀察。