截至21日H7N9禽流感已確診102例，雖未有大面積爆發(fā)，但快速檢測(cè)與診斷、確診疫情發(fā)生與否已成為防控工作的關(guān)鍵。4月17日，北京檢驗(yàn)檢疫局承擔(dān)的國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目“禽流感病毒H7N9亞型雙重?zé)晒釸T-PCR定型技術(shù)研究”鑒定會(huì)上，專家組一致同意項(xiàng)目成果通過(guò)鑒定，并建議在進(jìn)一步擴(kuò)大和完善動(dòng)物臨床驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，盡快推廣應(yīng)用。

　　目前，在國(guó)內(nèi)通用的確診禽類中禽流感病毒H7N9亞型的檢測(cè)技術(shù)中，除采用傳統(tǒng)的雞胚病毒分離方法外，通常采用核酸檢測(cè)方法，如普通PCR方法和基于熒光RT-PCR的“二步法”，但還沒(méi)有建立起采用熒光RT-PCR技術(shù)“一步法”檢測(cè)禽流感病毒H7N9亞型的方法。

　　據(jù)該項(xiàng)目組負(fù)責(zé)人、北京局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室博士高志強(qiáng)介紹，項(xiàng)目在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，共建立了3種檢測(cè)方法。最終的禽流感病毒H7N9亞型雙重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法是在禽流感病毒H7亞型和N9亞型單重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上通過(guò)優(yōu)化建立，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)禽流感病毒H7N9亞型的一步快速定型。這種方法不僅能檢測(cè)最近流行的H7N9毒株，還可以用于篩查其他H7亞型毒株。此方法不僅引物特異，而且探針特異，這一“雙特異”性保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時(shí)比普通PCR檢測(cè)技術(shù)要靈敏100~1000倍。

　　熒光RT-PCR檢測(cè)禽流感病毒原理

　　熒光RT-PCR就是在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)原有的一對(duì)特異性引物基礎(chǔ)上增加了一條特異性熒光雙標(biāo)記探針。標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位——北京出入境檢驗(yàn)檢疫局的科研人員根據(jù)A型流感病毒的核酸保守區(qū)共有序列，開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)上百對(duì)引物和幾十條探針序列，從中篩選出了敏感、特異的引物、探針，建立快速的通用型一步法檢測(cè)活禽或禽產(chǎn)品中所有A型禽流感病毒及針對(duì)H5、H7、H9亞型的熒光RT-PCR檢測(cè)技術(shù)。

　　PCR反應(yīng)進(jìn)行一個(gè)循環(huán)，在合成了N條新鏈的同時(shí)，就水解了N條探針，并釋放出了相應(yīng)數(shù)量的熒光基團(tuán)。儀器所接收到熒光信號(hào)的強(qiáng)度與PCR反應(yīng)產(chǎn)物的量呈對(duì)應(yīng)關(guān)系。隨著PCR反應(yīng)的循環(huán)往復(fù)，PCR產(chǎn)物呈指數(shù)形式增長(zhǎng)，熒光信號(hào)也相應(yīng)增長(zhǎng)。如果以每一個(gè)PCR循環(huán)結(jié)束時(shí)所測(cè)得的熒光值為縱坐標(biāo)，以PCR循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，即可得到一條連接每一個(gè)循環(huán)后熒光值的擴(kuò)增曲線。當(dāng)檢測(cè)標(biāo)本中含有所要檢測(cè)病原體的核酸序列時(shí)，所得到的曲線呈“S”型;而當(dāng)標(biāo)本中不含病原體，則PCR過(guò)程不發(fā)生，探針不被水解，不產(chǎn)生熒光信號(hào)，其擴(kuò)增曲線為一水平線。也就是說(shuō)，擴(kuò)增曲線為“S”型時(shí)，就檢出了禽流感病毒;當(dāng)擴(kuò)增曲線為水平線時(shí)，就沒(méi)有禽流感病毒檢出。利用熒光RT-PCR檢測(cè)方法的4項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)有3項(xiàng)分別是對(duì)H5、H7、H9亞型禽流感病毒檢測(cè)提出的，還有一項(xiàng)是通用檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)。北京出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫實(shí)驗(yàn)室主任張鶴曉介紹說(shuō)，該方法可以檢測(cè)H1～H15的各種禽流感病毒。

　　禽流感病毒各亞型均屬A型流感病毒，根據(jù)A型流感病毒共有基因特定的序列，合成一對(duì)特異性引物和一條特異性的熒光雙標(biāo)記探針。該探針與禽流感病毒特有的共同基因特異性結(jié)合，結(jié)合部位位于引物結(jié)合區(qū)域內(nèi)。探針的5’端和3’端分別標(biāo)記不同的熒光素，如5’端標(biāo)記FAM熒光素，它發(fā)出的熒光能夠被檢測(cè)儀器接收，稱為報(bào)告熒光基團(tuán)(用R表示)，3’端一般標(biāo)記TAMRA熒光素，它在近距離內(nèi)能吸收5’端報(bào)告熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)，稱為淬滅熒光基團(tuán)(用Q表示)。

　　當(dāng)PCR反應(yīng)在退火階段時(shí)，一對(duì)引物和一條探針同時(shí)與目的基因片段結(jié)合，此時(shí)探針上R基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被Q基團(tuán)所吸收，儀器檢測(cè)不到R所發(fā)出的熒光信號(hào);當(dāng)PCR反應(yīng)進(jìn)行到延伸階段時(shí)，Taq酶在引物的引導(dǎo)下，以四種核苷酸為底物，根據(jù)堿基配對(duì)的原則，沿著模板鏈合成新鏈;當(dāng)鏈的延伸進(jìn)行到探針結(jié)合部位時(shí)，受到探針的阻礙而無(wú)法繼續(xù)，此時(shí)的Taq酶發(fā)揮它的5’→3’外切核酸酶的功能，將探針?biāo)�解成單核苷酸，消除阻礙，與此同時(shí)標(biāo)記在探針上的R基團(tuán)游離出來(lái)，R所發(fā)出的熒光再不為Q所吸收而被檢測(cè)儀所接收;在Taq酶的作用下繼續(xù)延伸過(guò)程合成完整的新鏈，R和Q基團(tuán)均游離于溶液中，儀器可繼續(xù)檢測(cè)到R所發(fā)出的熒光信號(hào)。

　　熒光RT-PCR檢測(cè)法特點(diǎn)

　　敏感性高、特異性強(qiáng)：熒光RT-PCR檢測(cè)方法不僅能夠用來(lái)檢測(cè)禽流感病毒H5、H7、H9亞型，對(duì)其他禽流感病毒亞型也能檢出，而且用通用型探針、引物檢測(cè)常見(jiàn)的其他禽類病毒，未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)，這就說(shuō)明該方法敏感性高、特異性強(qiáng)。

　　節(jié)約檢測(cè)時(shí)間：在檢驗(yàn)檢疫實(shí)踐中，如果用僅針對(duì)某一亞型禽流感病毒的探針、引物，一個(gè)亞型一個(gè)亞型的測(cè)試，勢(shì)必會(huì)浪費(fèi)人力、物力和時(shí)間。因此，先用通用型探針、引物驗(yàn)證是否是禽流感病毒，再用亞型的探針、引物分型，將大大節(jié)約檢測(cè)時(shí)間。

　　不易污染：熒光RT-PCR技術(shù)通過(guò)連接電腦分析PCR過(guò)程中產(chǎn)生的熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)、在線檢測(cè)PCR擴(kuò)增過(guò)程，而無(wú)需對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行后處理，克服了傳統(tǒng)的PCR技術(shù)易污染的缺點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)在同一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的操作程序條件下進(jìn)行穩(wěn)定、可靠的檢測(cè)。