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結(jié)晶紫法檢測(cè)TNF的生物活性

[2012/5/4]

  TNF包括TNFα與TNFß兩型,它們具有極其相似的生物學(xué)活性,在體內(nèi)外可對(duì)一些腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞系起殺傷作用,而對(duì)正常細(xì)胞則無細(xì)胞毒效應(yīng)。根據(jù)這一特點(diǎn),可利用TNF對(duì)敏感靶細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng),在體外檢測(cè)TNF的活性水平,既可檢測(cè)分泌型TNF(sTNF),也可檢測(cè)膜結(jié)合型TNF(mTNF)。最常用的方法是體外檢測(cè)TNF對(duì)小鼠成纖維瘤細(xì)胞(L929細(xì)胞)的細(xì)胞毒效應(yīng)。

  【基本原理】

  TNF對(duì)L929細(xì)胞有細(xì)胞毒作用,如同時(shí)加用轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D,則可提高L929細(xì)胞對(duì)TNF的敏感性10~100倍。利用染料結(jié)晶紫或MTT可使活細(xì)胞染色,再用脫色液將染料脫出,測(cè)定其OD值,即可反應(yīng)細(xì)胞的存活狀態(tài)或TNF對(duì)L929細(xì)胞的殺傷率,通過計(jì)算細(xì)胞死亡率,并與sTNF標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照,即可檢測(cè)待測(cè)樣品sTNF活性單位。

  【材料和試劑】

  (1)L929細(xì)胞株(存活率應(yīng)>95%)

  (2)TNF標(biāo)準(zhǔn)品:作倍比稀釋(100U/ml~0.1U/ml)。

  (3)待測(cè)樣品:作倍比稀釋至少6個(gè)不同稀釋度。

  (4)0.25%胰蛋白酶

  (5)RPMI-1640培養(yǎng)液及PBS

  (6)0.25%結(jié)晶紫(溶于20%甲醇中),或者5mg/mlMTT(溶于PBS中)

  (7)放線菌素D(分存液濃度為100ug/ml)

  (8)檸檬酸鈉緩沖液(0.9%檸檬酸鈉,0.02mol/L鹽酸,47.5%乙醇,為脫色液);酸化異丙醇(0.04mol/LHCL異丙醇)

  (9)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,刻度吸管,毛細(xì)吸管,加樣器(頭),刻度離心管,離心機(jī),細(xì)胞計(jì)數(shù)板,倒置顯微鏡,超凈工作臺(tái),CO2培養(yǎng)箱。

  (10)酶標(biāo)測(cè)定儀,570nm濾光片,630nm濾光片。

  【操作步驟】

  (1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L929細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶消化2-3min,然后洗滌細(xì)胞2次,以去除消化液及原生長(zhǎng)培養(yǎng)液;

  (2)用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)L929細(xì)胞濃度為2×105/ml;

  (3)將上述細(xì)胞懸液加至96孔培養(yǎng)板,100ul/孔;

  (4)置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;

  (5)吸去細(xì)胞培養(yǎng)上清液后,各孔分別加入倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品,100ul/孔,各設(shè)雙復(fù)孔,并設(shè)培養(yǎng)液陰性對(duì)照及空白對(duì)照(即L929細(xì)胞、標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品均不加入,僅加培養(yǎng)液);

  (6)同時(shí)向各孔均加入10ul放線菌素D(0.5~1μg/孔);

  (7)置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-14h;

  (8)甩棄上清,并用RPMI-1640培養(yǎng)液洗細(xì)胞1次;

  (9)每孔均加入0.25%結(jié)晶紫,100μl/孔,室溫下染色10min;

  (10)甩棄上清,再用PBS洗板3次;

  (11)室溫下涼干,加入檸檬酸鈉緩沖液脫色,100μl/孔;

  (12)充分混勻后,用酶標(biāo)儀以檢測(cè)波長(zhǎng)570nm,參考波長(zhǎng)630nm測(cè)各孔OD值。