一、分光光度計的工作原理
  分光光度法是根據(jù)被測物質(zhì)分子對紫外、可見波段范圍單色輻射的吸收或反射強度來進行物質(zhì)的定性、定量或結(jié)構(gòu)分析的一種方法。
  物質(zhì)呈現(xiàn)特征的顏色，這是由于它們對可見光中某些特定波長的光線選擇性吸收的緣故。實際上，一切物質(zhì)都會對可見光和不可見光中的某些波長的光線進行吸收。但是，一切光線并不都是以相同的程度被物質(zhì)吸收的。物質(zhì)對不同波長的光線表現(xiàn)不同的吸收能力，叫做選擇性吸收。各種物質(zhì)對光線的選擇性吸收這一性質(zhì)，反映了它們分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)的差異，即各種物質(zhì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)決定了它們對不同光線的選擇吸收。
  朗伯-比耳定律 （Lambert-Beer）是幾乎所有的光學(xué)分析儀器的基本工作原理，它由朗伯定律和比耳定律合并而成。 
          朗伯定律表明：如果溶液的濃度一定，則光對物質(zhì)的吸收程度與它通過的溶液厚度成正比。 
          比耳定律表明：如果吸光物質(zhì)溶于不吸光的溶劑，則吸光度和吸光物質(zhì)的濃度成正比。 
兩者合成后的數(shù)學(xué)表達式如下： 
      T=I/I。 （1） 
      A=KCL=‐㏒ I/Io （2） 
其中 
    T 透過率 
    A 吸光度 
    C 溶液濃度 
    K 溶液的吸光系數(shù) 
    L 液層在光路中的長度  
    I 光透過被測試樣后照射到光電轉(zhuǎn)換器上的強度 
    Io 光透過參比測試樣后照射到光電轉(zhuǎn)換器上的強度 

二、產(chǎn)品類型結(jié)構(gòu)：

光度計
      可見分光光度計  
           紫外/可見分光光度計    
                 掃描型紫外/可見分光光度計
                        雙光束紫外/可見分光光度計 

三、儀器技術(shù)參數(shù)解釋
     波長范圍：儀器可選波長的測量范圍。不同的物質(zhì)吸收所對應(yīng)的吸收波長不一樣。 
    氘燈：紫外光源                    185-400nm 
    鎢燈：可見和近紅外光源      250---2000nm              
   光譜帶寬：目前國際上對光譜帶寬的測試方式一般用“譜線輪廓法”，主要是選用某些光源的特征譜線，對它進行光譜掃描，繪出該譜線的輪廓，再測出該譜線的半峰高的寬度即為光譜帶寬（又稱自然光譜帶寬）。儀器使用的光譜帶寬通常要比自然光譜帶寬小10倍以上。
    波  長  準(zhǔn)  確  度：也叫波長精度，是波長的實際測定值與理論值的差值。
   波  長  重  復(fù)  性：多次測量（一般是3次）最大值與最小值之間的差值。
   光  度  準(zhǔn)  確  度：光度測量值與光度理論值之差。 
   影響光度準(zhǔn)確度的主要因素： 
      ①雜散光      ②光度噪聲      ③基線平直度 
      ④光譜帶寬  ⑤試樣來源      ⑥試樣制備 
      ⑦比色皿 
   光  度  重  復(fù)  性：多次測量（一般是3次）最大值與最小值之間的差值。  
   影響光度重復(fù)性的主要因素： 
      ①光源系統(tǒng)（氘燈、鎢燈）       
      ②光電轉(zhuǎn)換器系統(tǒng) 
      ③電源系統(tǒng)       
      ④環(huán)境 
  雜    散    光：不同于測試所需要的波長的光叫做雜散光。 

影響雜散光的主要因素： 
  ①灰塵沾污光學(xué)元件   ②隔板邊緣的反射 
  ③光學(xué)系統(tǒng)屏蔽不好   ④狹縫的缺陷 
  ⑤光束孔徑不匹配       ⑥光學(xué)系統(tǒng)的像差 
  ⑦單色器內(nèi)壁黑化處理不當(dāng)   等等 

      雜散光對分析測試結(jié)果的誤差影響是隨著吸光度值增大而增大的，會使結(jié)果偏離比耳定律。 
       
      ·雜散光被試樣吸收時，偏離是正值。 
      ·雜散光不被試樣吸收時，偏離是負(fù)值。  

穩(wěn)    定    性：穩(wěn)定性包括基線漂移和光度重復(fù)性。 
       
基線漂移是指冷態(tài)開機預(yù)熱2小時后調(diào)零，試劑和參比比色皿都為空氣，在固定波長（500nm）下連續(xù)測定吸光度1小時，最大值和最小值之差。 
光度噪聲（噪聲）： 
      
       噪聲是指冷態(tài)開機預(yù)熱0.5小時后調(diào)零，試劑和參比比色皿都為空氣，在500nm下連續(xù)測定吸光度1小時，偏離零點的最大值。 
      基線平直度： 
      基線平直度是指冷態(tài)開機預(yù)熱0.5小時后調(diào)零，從長波長向短波長對儀器進行全波長慢速掃描吸光度，偏離零點的最大值。 
吸光度和透過率的關(guān)系：透過率和吸光度是一一對應(yīng)的關(guān)系，關(guān)系式如下： 
A=2 – lgT% 
其中    A為吸光度 
           T為透過率 
        若T=100%，A = 2 - lg100 = 2 - 2 = 0 
        若T=10%  ，A = 2 - lg10   = 2 - 1 = 1 
光度分析：固定波長下測定樣品的吸光度和透過率。 

定量分析：通過對已知濃度的樣品進行吸光度的測定，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出曲線的線性方程C=KA+b。再測定未知樣品的吸光度，通過線性方程求出樣品的濃度。 
動力學(xué)測試：固定波長下，測定樣品在一段時間內(nèi)吸光度或透過率的變化圖譜，可計算樣品的反應(yīng)率△A/t。 
       
    需設(shè)定的參數(shù)： 
         掃描時間，最多9小時； 
         采樣間隔，最小為0.5秒； 
         延時時間 
         掃描波長 
全波長掃描：在儀器波長范圍內(nèi)，設(shè)定任意波長區(qū)間，對未知試樣進行吸光度、透過率的圖譜掃描。 
       
     需設(shè)定的參數(shù)： 
         掃描波長范圍 
         掃描間隔，0.1、0.2、0.5、1、2、5nm； 
         掃描速度，建議為低速； 
         T/A模式 
圖譜處理 
     圖譜放大、縮小、峰谷檢測、平滑等處理； 
     圖譜存儲和調(diào)用； 
     使用PC版軟件可進行1-4階求導(dǎo)、四則運算、疊加等分析。
多波長測試：對某一待測物質(zhì)在多個波長點進行吸光度、透過率測試。 
  
    單機版可測試10個波長點； 
      PC版可測試32個波長點。
DNA/蛋白質(zhì)測試 
    測試波長缺省值為260、280、320nm，可修改。 
    可計算DNA、Protein的濃度和Ratio。 

單光束分光光度計特點：結(jié)構(gòu)簡單、價格便宜 

雜散光、光度噪聲、光譜帶寬等主要技術(shù)指標(biāo)差，不適合用于技術(shù)要求較高的行業(yè)，如制藥、科研、質(zhì)量檢驗行業(yè)。 
準(zhǔn)雙光束分光光度計特點：結(jié)構(gòu)較簡單、價格較便宜。 
有一束作為參考光束，能部分抵消光源振動、電子學(xué)噪聲，以提高儀器的穩(wěn)定性。 
只有一個比色皿，不能抵消雜散光。
雙光束雙轉(zhuǎn)換器分光光度計特點：能部分抵消光源波動、雜散光、電噪聲的影響，光度準(zhǔn)確好； 
結(jié)構(gòu)較復(fù)雜、價格昂貴； 
因一束光分為兩束，每束光的能量低，信噪比不如單光束光度計好； 
兩個轉(zhuǎn)換器不能完全匹配，故掃描測量誤差大，不建議用來做光譜掃描。
雙光束單檢測器分光光度計特點：能部分抵消光源波動、雜散光、電噪聲的影響，光度準(zhǔn)確好、技術(shù)指標(biāo)很先進； 
結(jié)構(gòu)較復(fù)雜、價格昂貴； 
因一束光分為兩束，每束光的能量低，信噪比不如單光束光度計好。但兩束光路對噪聲可相互抵消，靈敏度仍然很好。 

四、分光光度計的評價和挑選：
    適用性 
    可靠性 
    智能型 
    經(jīng)濟性 
    美學(xué)性 
    工藝性 
適    用    性：適用性—滿足使用要求的程度，主要由技術(shù)指標(biāo)所決定。 
波長準(zhǔn)確度： 
對于一般的定量分析，波長準(zhǔn)確度不是很重要； 
對不同試樣進行比對測試時，波長準(zhǔn)確度就相當(dāng)重要。 

雜散光： 
      在分析的試樣較多，濃度較大時很重要。 

雜散光一定時，分析測試的數(shù)據(jù)會隨著濃度的增大，偏離比耳定律的程度就越大，故對待測試樣的濃度上限有嚴(yán)格要求； 
分析品種較多的食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，必須挑選雜散光小的儀器。 

光度噪聲： 
      分析測試誤差的主要來源，且限制被分析試樣濃度的下限。 

光度噪聲一定時，濃度越低，分析測試的數(shù)據(jù)的誤差就越大，故對待測試樣的濃度下限限制較大； 
生化、海洋研究等領(lǐng)域，必須挑選光度噪聲小的儀器。 
光譜帶寬 

一般常規(guī)的在可見光區(qū)的分析工作，帶寬一般選擇4nm； 
用于制藥行業(yè)的藥檢，光譜帶寬在2nm或以下； 
科研工作建議選擇可調(diào)帶寬的儀器。 
可    靠    性：從狹義上講，可靠性就是儀器的故障率。 

從廣義上講，可靠性應(yīng)從分光光度計的制造和使用兩個方面衡量，包括光度準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性、故障率及售后服務(wù)等內(nèi)容。 

影響可靠性的因素：首先要查看自己對儀器條件（如光譜帶寬、掃描速度、采樣間隔、標(biāo)尺設(shè)定等）的選擇是否恰當(dāng)，是否對儀器進行了調(diào)零、基線校正、暗電流校正等； 
要嚴(yán)格檢查影響儀器光度準(zhǔn)確度的主要指標(biāo)：雜散光、光學(xué)元件（尤其是舊機器）、光度噪聲、基線平直度； 
檢查比色皿是否被污染； 
查看周圍有無干擾源，主要是電和磁的干擾； 
檢查試樣制備的過程； 
檢查試樣是否過期等等。